Detección destem cell leucémica (CD26+) en pacientes con leucemia mieloide crónica con diferente respuesta molecular

 

Detection of leukemic stem cell (CD26+) in patients with chronic myeloid leukemia with different molecular response

 

Bengió RM1, Peña M1, Palacios F1, Moiraghi B2, Negri Aranguren P3, Enrico A4, Mariano R5, Toloza MJ6, Larripa I6.

 

1.     Instituto de Investigaciones Hematológicas, Academia Nacional de Medicina

2.     Servicio Hematología Hospital Ramos Mejía

3.     Instituto Privado Hematología y Hemoterapia

4.     Hospital Italiano de La Plata

5.     Hospital San Martín

6.     Instituto IMEX, CONICET- Academia Nacional de Medicina

 

irenelarripa@gmail.com

 

Palabras clave:         LMC,

                                   célula madre leucémica,

                                   CD26+,

                                   respuesta molecular profunda.

 

Keywords:     CML,

                        leukemic stem cell,

                        CD26+,

                        deep molecular response.

 

Resumen

La leucemia mieloide crónica (LMC) se caracteriza por la t(9;22)(q34;q11), generando el gen de fusión BCR-ABL1 que codifica la oncoproteína P210 con actividad constitutiva de tirosina kinasa. Los pacientes que presentan una respuesta molecular profunda y sostenida a los inhibidores de tirosina kinasa (ITK) pueden interrumpir el tratamiento. Sin embargo, aproximadamente el 50% de los casos presentan recurrencia molecular, probablemente debido a la persistencia de la célula madre leucémica (SCL) quiescente (no replicativa, transcripcionalmente silente).

Publicaciones recientes han demostrado que la expresión de la enzima dipeptidil peptidasa IV (CD26) está restringida a la fracción CD45+/CD34+/CD38- de la SCL en LMC y no se ha detectado en otras SCL mieloides/linfoides ni en médula ósea normal. Por esta razón CD26 es considerado un bio-marcador nuevo y específico de LMC.

El objetivo del trabajo fue detectar las SCL CD26+ en pacientes con LMC con diferente respuesta molecular (RM) y determinar si estas células persisten aun en casos con respuesta molecular profunda (RMP).

Se analizaron 193 muestras de pacientes con LMC (107 sexo masculino y 86 femenino) para evaluar la SCL mediante citometría de flujo usando el panel de anticuerpos monoclonales: CD45, CD34, CD38, CD26, CD117, CD123, CD3 y HLA-DR. En paralelo se realizó el estudio de la respuesta molecular mediante qRT-PCR BCR-ABL1 (MétodoTaqman). Ambos estudios se realizaron en simultáneo en la misma muestra, durante el seguimiento en diferentes momentos bajo tratamiento con ITK (imatinib, nilotinib o dasatinib).

Los pacientes con una reducción de BCR-ABL1 ≥ a 3 log tenían una proporción de casos significativa menor con SCL CD26+ comparado con aquéllos que tenían <3 log de reducción de los transcriptos (p<0.0003, OR: 3.4, 95% CI: 1,7 - 6,8). Considerando los 76 casos con RMP (33 RM 4.0; 38 RM 4.5 y 5 RM 5.0), solamente 12/76 (16%) mostraron persistencia de la SCL CD26+. La presencia de la SCL CD26+ se redujo acorde aumenta la profundidad de la RM: 21%, 13% y 0% en RM 4.0, RM 4.5 y RM 5.0 respectivamente.

Nuestros resultados muestran que los pacientes con RM buena (≥3 log) se asociaron con baja proporción de casos con SCL CD26+. Cuando la detección de SCL se evaluó exclusivamente en los casos con RMP, se observó que el decrecimiento de la SCL se asoció a mayor profundidad de la RM. La célula madre leucémica es altamente quiescente, por lo cual podría estar presente aun en casos con respuesta molecular indetectable. En nuestro estudio la persistencia de SCL fue del 16% en casos con respuesta molecular profunda, indicando que la SCL persiste a pesar de la RM alcanzada. Este nuevo abordaje investigando la SCL podría ser útil en el seguimiento a largo plazo y de gran importancia en la evaluación de la recurrencia molecular en los casos incluidos en protocolos de discontinuación.

 

Abstract

Chronic myeloid leukemia (CML) is characterized by the reciprocal translocation t(9;22)(q34;q21) resulting in the BCR-ABL1 fusion gene encoding the P210 oncoprotein with a constitutive tyrosine kinase (TK) activity. It is known that patients with at least two years in deep and sustained molecular response could stop TK inhibitor (TKI) treatment. However, half of them show molecular recurrence, probably due to the persistence of transcriptionally quiescent leukemic stem cells (LSC). Recent studies show that the expression of the enzyme dipeptidylpeptidase IV (CD26) is mainly restricted to the CD45+/CD34+/CD38- fraction in CML LSC, and it is not found in other myeloid/lymphoid LSC or in normal bone marrow. For this reason, CD26 is considered a novel specific biomarker in CML.

The aim of this study was to detect the CD26+ LSC in CML patients with different molecular responses (MR) and to assess if these cells remain even in deep molecular response (DMR).

We have evaluated 193 CML patients (107 males and 86 females) for detection of LSC by flow cytometry using the panel: CD45, CD34, CD38, CD26, CD117, CD123, CD3 and HLA-DR and the BCR-ABL1 quantification by qRT-PCR (Taqman method). Both studies were carried out simultaneously on the same sample, during the follow up at different time points under TKI treatment (imatinib, nilotinib, dasatinib).

Patients with ≥ 3 BCR-ABL1 log reduction had a significantly lower percentage of cases with CD26+ LSC compared with those who had < 3 log reduction (p<0.0003, OR: 3.4, 95% CI: 1,7 - 6,8). Out of the 76 patients with DMR (33 in MR 4.0, 38 in MR 4.5 and 5 in MR 5.0) only 12/76 (16%) showed persistence of CD26+ LSC. Furthermore, the presence of CD26+ LSC decreased accordingly to the achieved DMR: 21%, 13% and 0% in MR 4.0, MR 4.5 and MR 5.0 respectively, without significant differences.

Our results show that patients with good MR (≥3 log) were significantly associated with a lower proportion of cases with LSC presence. When the LSC analysis was performed exclusively in cases with DMR, we observed that the decrease of LSC accompanied the deepness of the molecular response. Since the LSC is highly quiescent, it could be present even in cases with undetectable MR. In our study persistence of LSC in cases with DMR was 16%, indicating that these cells remain present despite the MR achieved. This new approach to the study of the LSC could be useful in long-term follow-up and of great importance in the evaluation of molecular recurrence in cases included in discontinuation protocols.

 

Introducción

La leucemia mieloide crónica (LMC) es una neoplasia mieloproliferativa clonal caracterizada por la adquisición de una translocación cromosómica específica denominada cromosoma Philadelphia (Ph’) [t(9;22)(q34;q11)](1). Esta alteración citogenética produce el gen de fusión BCR-ABL1, que origina una proteína oncogénica, p210BCR-ABL con actividad constitutiva de tirosina kinasa(2). El estudio de la funcionalidad de esta proteína derivó en el desarrollo de los inhibidores de tirosina kinasa (ITK), los cuales determinaron un cambio revolucionario en el tratamiento de la LMC(3,4). Recientemente se ha demostrado que los pacientes con respuesta molecular profunda y sostenida pueden ser incluidos en protocolos de discontinuación del tratamiento bajo controles estrictos de BCR-ABL1 cuantitativo. Sin embargo aproximadamente la mitad de los casos que interrumpen la terapia con ITK presentan recurrencia de transcriptos BCR-ABL1 con pérdida de la respuesta molecular mayor, lo cual implica el reinicio del tratamiento(5,6). Es probable que la recaída después de la discontinuación del tratamiento se deba a la persistencia de células madre leucémicas (SCL) quiescentes que son transcripcionalmente silentes y sobreviven indefinidamente en nichos hipóxicos(7).

Tratando de identificar nuevos marcadores que permitan caracterizar la SCL de la LMC respecto de otras neoplasias mieloides o de la célula madre hematopoyética (SCH) normal se realizaron estudios con microarray evaluando la expresión de numerosos marcadores de superficie en el compartimento celular primitivo [CD34+/CD38-]. De todos los antígenos de superficie examinados, la enzima CD26 o dipeptidilpeptidasa IV (DPPIV) resultó ser la más específica, dado que se identificó en todos los casos con LMC, no detectándose en la SCH normal ni en las SCL de otras neoplasias mieloides, indicando que CD26 se comporta como un marcador robusto y especifico de SCL de LMC(8,9).

CD26 se expresa tanto en médula ósea (MO) como en sangre periférica (SP)(10), lo cual permite el análisis de la SCL empleando citometría de flujo en muestras de SP evaluando la co-expresión de CD26 en el compartimento celular primitivo [CD45+/CD34+/CD38-].

También se ha podido demostrar que la SCL de la LMC expresa varios antígenos de superficie (CD44 y CXCR4 o CD184) que participan de las interacciones con el microambiente medular mediante el SDF-1 (Stromal Derived Factor1) liberados por las células del estroma medular. Ensayos funcionales han determinado que CD26 se comporta como una enzima que impide la asociación entre SDF1-CXCR4, degradando el SCF1 (ligando de CXCR4), lo cual facilita el escape y movilización extramedular de la SCL en la LMC(8,11,12).

Actualmente el seguimiento de la respuesta al tratamiento con ITK en LMC se realiza mediante el estudio de la cuantificación de los transcriptos BCR-ABL1 por técnicas de qRT-PCR en tiempo real. Esta metodología permite definir la respuesta al tratamiento (óptima, warning o fallo), teniendo en cuenta los criterios del European Leuk Net(4,13).

Si bien la cuantificación de los transcriptos BCR-ABL1 es uno de los criterios fundamentales en el seguimiento de esta patología, trabajos actuales sugieren que la identificación de la SCL a lo largo de la evolución de la enfermedad sería sin duda un parámetro muy importante a tener en cuenta en la respuesta y recurrencia de la enfermedad luego de la discontinuación del tratamiento.

 

Objetivo

Investigar la presencia de las SCL CD26+ en pacientes con LMC con diferente respuesta molecular y determinar si estas células leucémicas persisten aún en los casos con respuesta molecular profunda (RMP) y/o indetectable.

 

Materiales y métodos

Se analizaron muestras de sangre periférica (SP) extraídas con EDTA de 193 pacientes adultos, mayores a 18 años, 107 varones y 86 mujeres con diagnóstico de LMC en tratamiento con ITK de primera y segunda generación. La edad media fue 48 años, rango 18-82. Las muestras de los pacientes se evaluaron en diferentes etapas de la evolución de la enfermedad y provinieron del IIHEMA y de instituciones derivantes. Se realizaron estudios moleculares de seguimiento de PCR en tiempo real (qRT-PCR) para cuantificar los transcriptos BCR-ABL1. En paralelo se efectuó el análisis por citometría de flujo para evaluar el compartimento celular CD45+/CD34+/CD38-/CD26+ correspondiente a la SCL de la LMC.

La extracción del ARN se llevó a cabo con el método del Trizol. La respuesta molecular (RM) en escala internacional respecto del gen control ABL1 se realizó utilizando el kit molecular MD y el termociclador Rotor gene (Qiagen). Por citometría de flujo se evaluó la expresión del antígeno CD26 (enzima dipeptidilpeptidasa IV, DPPIV) en células madre totales (CD45+/CD34+/CD38-). Para la adquisición de las muestras marcadas se utilizó el citómetro de flujo FACS CANTO II (BD); FACS DIVA (versión 8, BD Biosciences). El panel utilizado incluye los siguientes anticuerpos: CD45 (V450 clon 2D1), CD34 (PERCP Cyanina 5.5, clon 8G12), CD38 (FITC, clon HB7) y CD26 (PE L272).

Consideraciones éticas. Los pacientes firmaron un consentimiento informado donde se indica la confidencialidad de toda la información de este estudio según pautas de la legislación nacional e internacional vigente, El nombre de los pacientes cuyas muestras de sangre han sido utilizadas solidariamente no será almacenado en ningún registro ni revelado en ninguna publicación o presentación de los resultados del estudio. Se seguirán estrictamente las pautas éticas internacionales.

 

Resultados

La población evaluada incluyó 193 pacientes con las siguientes respuestas moleculares al momento del estudio: 12/193 (6%) RMNula, 17/193 (9%) RMMínima, 31/193 (16%) RMMenor, 57/193 (30%) RMMayor y 76/193 (39%) RMProfunda (incluye 33 RM 4.0, 38 RM 4.5 y 5 RM 5.0). El porcentaje de casos con presencia de CD26+ fue disminuyendo a medida que aumenta la profundidad de la RM (Tabla 1). En la figura 1 (1A, 1B, 1C) se observan los distintos histogramas correspondientes a pacientes con célula madre hematopoyética normal (SCH) (1A) y célula madre leucémica (SCL) (1B y 1C).

 

Tabla 1. Proporción de casos CD26+ y CD26- teniendo en cuenta la respuesta molecular

*SCL CD26+: célula madre leucémica CD26+

#SCH CD26- : célula madre hematopoyética normal CD26-

 

 

Figura 1. Imnunofenotipo de célula madre hematopoyética normal (SCH) y célula madre leucémica (SCL). A. Paciente con ausencia de SCL. Pico rojo: SCH CD34+/CD38-/ CD26-. Pico azul: linf. T (Control +). B. Paciente con presencia de SCL. Pico amarillo: SCL CD34+/CD38-/CD26+. Pico rojo: SCH CD34+/CD38-/CD26-. Pico azul: linf. T (Control +). C. Paciente con presencia de SCL. Pico amarillo: SCL CD34+/CD38-/CD26+. Pico rojo: SCH CD34+/CD38-/CD26-  Pico azul: linf. T (Control +).

 

 

 

Figura 2. Porcentaje de células madre leucémicas (SCL CD26+) en las diferentes respuestas moleculares respecto de la RM nula. Kruskal Wallis: *p<0,05; **p<0,01; ***p< 0,0007 vs RM nula.

 

 

 

Tabla 2. Distribución de la célula madre CD26+ y célula madre CD26- respecto a la respuesta molecular (<3 log o ≥3 log)

 

 

 

Cuando se analizó el porcentaje de la SCL CD26+ en la población CD34+/CD38- en las diferentes RM alcanzadas (Figura 2), no se encontraron diferencias significativas, excepto con la RMNula, la cual difería estadísticamente de las respuestas moleculares restantes [Kruskal Wallis: p<0,05 vs RMMenor, p<0,01vs RMMayor, p<0,01 vs RM4.0, p<0,0007 vs RM4.5 y p<0,0007 vs RM5.0].

Por lo tanto las diferentes RM se dividieron en dos grupos: pacientes con RM muy buena (≥3 log de reducción de los transcriptos BCR-ABL1) incluyendo la RMMayor, RM4.0, RM4.5, RM5.0 y los que tenían RM mala (<3 log) conteniendo RMNula, RMMínima y RMMenor. La evaluación estadística mostró diferencias significativas entre ambos grupos [Fisher: P<0.0003, OR: 3,47 (CI: 1,76-6,82)] (Tabla 2, Figura 3).

Se pudo constatar que, a mayor profundidad de RM, disminuye el porcentaje de casos con CD26+. Cuando se analizaron exclusivamente los 76 pacientes con RMP se observó que el porcentaje de casos con persistencia de SCL CD26+ fue de 21%, 13% y 0% en RM 4.0, RM 4.5 y RM 5.0 respectivamente (Tabla 3 y Fig. 4).

Si bien estos datos no muestran diferencias estadísticamente significativas, se observa un aumento de la SCH normal CD26(-) a medida que aumenta la profundidad de la respuesta molecular (Figura 3).

 

Tabla 3. SCL CD26+ Respuesta molecular profunda (RM 4.0, RM 4.5, RM 5.0)

 

*SCL CD26+: célula madre leucémica CD26+

#SCH CD26- : célula madre hematopoyética normal CD26-

 

 

Figura 3. Células madre CD26+ / CD26- y respuesta molecular. p<0.0003, OR: 3.47 (CI: 1,76 - 6,82). La flecha indica los casos con respuesta molecular (≥ 3 log) y presencia de SCL CD26+, compatibles con célula madre quiescente.

 

 

 

Figura 4. Porcentaje de casos con RMP y persistencia de célula madre leucémica CD26+ (p=NS)

 

 

Discusión

La cuantificación de los transcriptos BCR-ABL1 por qRT-PCR constituyen el patrón oro para el monitoreo de la enfermedad mínima residual con alta sensibilidad(14,15,16). Sin embargo, este método es incapaz de detectar células neoplásicas que estén en un estado quiescente, no replicativo. Por lo tanto es importante incluir otros estudios que permitan caracterizar la SCL independientemente de su estado proliferativo, dado que la misma puede presentar períodos largos de latencia(17) dependiendo de la respuesta al tratamiento. La detección de la SCL analizando el inmunofenotipo permite investigar su persistencia a pesar de la ausencia de transcriptos BCR-ABL1(18).

Trabajos recientes de citometría de flujo investigando el inmunofenotipo de la SCL en LMC han permitido discriminarla de la SCH normal(8,10,19). De esta manera se logró determinar que el perfil CD45+/CD34+/CD38-/CD26+ es característico de la SCL en LMC y está ausente en médula ósea normal o leucemias mieloides/linfoides agudas(8,9) Adicionalmente, al separar por cell sorting poblaciones de SCL CD26+ y CD26- se pudo demostrar, aplicando la técnica de hibridización in situ (FISH) y qRT-PCR, que solamente las SCL CD26+ presentaban el rearreglo molecular BCR-ABL1(8).

Teniendo en cuenta esta información, en este trabajo se evaluó en la misma muestra de sangre periférica la SCL por citometría de flujo y la cuantificación de los transcriptos BCR-ABL1 por qRT-PCR en pacientes con LMC en diferentes estadíos de la evolución de la enfermedad a fin de investigar si en los casos con respuestas moleculares profundas persistía la SCL CD26+.

Nuestros resultados muestran que los pacientes con RM buena (≥3 log) se asocian significativamente a una menor proporción de casos con presencia de SCL. Cuando el análisis de SCL se realizó exclusivamente en casos con RMP, se observó una disminución de la misma a medida que aumentaba la profundidad de la respuesta molecular. Dado que la SCL puede persistir como una célula quiescente, no replicativa, podría permanecer incluso en casos con RM indetectable. En nuestro estudio la persistencia de SCL en los casos con RMP fue del 16%, indicando que estas células perduran a pesar de la RM lograda. Este nuevo enfoque podría ser útil durante el seguimiento de la enfermedad y análisis de la recurrencia molecular luego de la discontinuación del tratamiento. Estudios prospectivos permitirán definir las implicancias clínicas de la investigación de la persistencia de la SCL a pesar de la ausencia de transcriptos BCR-ABL1.

 

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